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QPNC-PAGE

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'''QPNC-PAGE''' (Abkürzung für ''engl.'': '''q'''uantitative '''p'''reparative '''n'''ative '''c'''ontinuous '''p'''oly'''a'''crylamide '''g'''el '''e'''lectrophoresis) ist eine spezielle Variante der Gelelektrophorese, einer Analytik analytischen Methode der Biochemie und Bioanorganische Chemie Bioanorganischen Chemie zur Trennung von Molekülen im Elektrisches Feld elektrischen Feld. Diese hochauflösende Trennmethode dient zur quantitativen Abtrennung und Isolierung von biologisch aktiven Metalloproteinen aus komplexen Biologie biologischen Analysenprobe Matrizes, wobei es sich um menschliche, Pflanzen pflanzliche oder Tiere tierische Proben handeln kann.

Elektrophoresepuffer und Gel
Als kontinuierlicher Elektrophoresepuffer wird bei QPNC-PAGE eine spezielle Pufferlösung, eine Gemisch Mischung aus 20 mM Tris-HCl und 1 mM Azide NaN3, mit dem pH-Wert 10,00 gewählt. ''Kontinuierlich'' bedeutet in diesem Zusammenhang, dass sowohl der Anodenpuffer, als auch der Kathodenpuffer sowie der Pufferlösung Puffer zur Herstellung des Polyacrylamid-Gels die gleiche chemische Analytische Chemie Zusammensetzung und Stoffkonzentration Konzentration haben. Die meisten Proteine eines lebenden Organismus sind bei dem pH-Wert von 10,00 negativ geladen und wandern im Elektrisches Feld elektrischen Feld daher von der Kathode zur Anode. Das Polyacrylamid-Gel muss auf Grund der Technik technischen Vorgaben der verwendeten Elektrophoresekammer vor jedem Lauf frisch hergestellt werden. Die Herstellung erfolgt prinzipiell so, wie es bereits in dem Artikel Polyacrylamid-Gelelektrophorese beschrieben ist. Das fertige Gel verfügt über eine Pore großporige Struktur mit einem Gesamtmonomerenanteil von 4% T (T = Gesamtanteil von Acrylamid und N,N-Methylenbisacrylamid im Gel [w/v]) mit einer Quervernetzung von 2,7 % C (C = Verhältnis N,N-Methylenbisacrylamid/Acrylamid [w/w]). Es verfügt über eine Höhe von 40 mm mit einem inneren Durchmesser von 28 mm. Der Anteil an TEMED als Polymerisierungs-Katalysator beträgt 0,05 % (v/v), der Anteil an Ammoniumpersulfat APS als Radikalstarter 0,5 % (v/v). Weitere Details zur Herstellung sind in den angegebenen Quellen veröffentlicht. Das Gel benötigt insgesamt 69 h Stunden zur vollständigen Polymerisation bei Raumtemperatur. Dieses Vorgehen bewirkt, dass sich keine freien Monomere mehr im Gel befinden, wodurch Chemische Reaktion Reaktionen von Gelkomponenten mit den zu isolierenden Analysenprobe Analyten ausgeschlossen werden können. Das Gel ist Mechanik mechanisch stabil und lässt sich gut handhaben. Die elektrophoretische Trennverfahren Trennung von Makromolekül Biomakromolekülen findet unter Kühlung in einer speziellen Elektrophoresekammer bei 4° C statt.

Trenneigenschaften und Quantifizierung
Die Eigenschaften des standardisierten Trennverfahren Verfahrens der QPNC-PAGE bewirken, dass bei einem Elektrophorese elektrophoretischen Lauf weder die Größen (Molekülmassen) noch die Formen (Gestalt) der zu isolierenden Proteine eine Trennung beeinflussen. Stattdessen erfolgt die Isolierung der aufgetrennten Proteine (Metalloproteine, Proteine mit organischen Cofaktoren und ohne Cofaktoren) und Peptide ausschließlich entsprechend der Zwitterion isoelektrischen Punkte (pI). Die aufgetrennten Moleküle wandern jeweils mit unterschiedlich konstanter Geschwindigkeit als ringförmige Proteinbanden durch das Gel und werden dann kontinuierlich von einem physiologischen Pufferlösung Puffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM Azide NaN3, pH-Wert 8,00) Elution eluiert. Bei einer Trennung werden weder die vorliegenden Komplexchemie Metall-Proteinkomplexe dissoziiert noch die nativen Konformationen verändert. Das Auflösungsvermögen der QPNC-PAGE für Coenzym Metallcofaktoren (z.B. Fe, Cu, Zn, Ni, Mo, Pd, Co, Mn, Pt, Cr oder Cd), die in verschiedenen Fraktionen gesammelt werden, bewegt sich im physiologisch wirksamen Bereich von ungefähr 1 Massenkonzentration ng/mL. Molekularsiebeffekte oder sonstige Interaktionen der Gelmatrix mit den Analysenprobe Analyten können auf Grund der Porengröße und Homogenität des Gels als vernachlässigbar gering eingestuft werden. Molekularsiebeffekte können bedeuten, dass Moleküle nach Molekülmasse Größe aufgetrennt werden. Ebenso finden während einer Trennung systembedingt keine Wechselwirkungen mit dem Elektrophoresepuffer statt. Diese Eigenschaften unterscheiden die QPNC-PAGE fundamental von der Nativ-Gelelektrophorese. Nach einer Nachweis (Chemie) Identifizierung mit der ICP-MS (Abkürzung für ''engl.'': '''i'''nductively '''c'''oupled '''p'''lasma '''m'''ass '''s'''pectrometry) kann ein isoliertes Protein aufgrund seiner hohen Reinheit und optimierten Stoffkonzentration Konzentration der NMR-Spektroskopie zugeführt werden. Näheres zum Thema der Identifizierung und Quantifizierung von Metalloproteinen findet sich in den angegebenen Quellen wieder.

Einsatzgebiete
Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie können ein- oder mehrdimensionale Proteinstruktur Proteinstrukturen in bestimmten PAGE-Fraktionen von nativen und Denaturierung (Biologie) denaturierten Metall-Proteinen aufgeklärt und mit Hilfe der Bioinformatik Proteinfaltung Struktur-Funktionsbeziehungen für bestimmte Metalloproteine (z.B. Chaperon (Protein) Metallochaperone, Prionen, Metalloenzyme, u.a.) ermittelt werden. Besonders wichtig ist dieser Ansatz für die Biomedizinische Analytik klinische Diagnostik und Therapie im Bereich von Krankheiten, deren Ursprung eine Proteinfaltung Fehlfaltung der Proteine ist, wozu beispielsweise Alzheimersche Krankheit, Parkinson-Krankheit, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und verschiedene Krebs (Medizin) Krebserkrankungen zählen.

Literatur
*B. Kastenholz: ''Important contributions of a new quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (QPNC-PAGE) procedure for elucidating metal cofactor metabolisms in protein-misfolding diseases – a theory.'' In: ''Protein Pept. Lett.'' 13, 2006, S. 503-508. ''Special issue [Hot Topic: Recent Advances in Protein and Peptide Chemistry Related to Cellular Regulation (Guest Editor: John W. Ho)].'' [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=16800806&query_hl=2&itool=pubmed_docsum] *B. Kastenholz: ''Comparison of the electrochemical behavior of the high molecular mass cadmium proteins in Arabidopsis thaliana and in vegetable plants on using preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (PNC-PAGE).'' In: ''Electroanalysis'' 18, 2006, S. 103-106.[http://dx.doi.org/10.1002/elan.200403344] *B. Kastenholz: ''Preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (PNC-PAGE): An efficient method for elucidating cadmium cofactors in biological systems.'' In: ''Anal. Letters'' 37, 2004, S. 657-665.[http://dx.doi.org/10.1081/AL-120029742]

Weblinks

- Patent_PAGE Kategorie:Elektrophorese en:QPNC-PAGE

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